产品货号:
LA10299
中文名称:
增强型细胞增殖及毒性检测试剂盒(CCK-8)
英文名称:
Cell Counting Kit-8
产品规格:
100T|500T|1000T|2000T|10000T
发货周期:
1~3天
产品价格:
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本产品是一种基于WST-8而广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测试剂盒,具有灵敏度高、反应时间短、线性范围宽、数据可靠、重现性好等特点,可以广泛应用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验。
CCK-8试剂中含有WST-8是一种类似于MTT的化合物,它在电子耦合试剂1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)存在条件下,可以被线粒体内的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物Formazan (参考图1),生成的Formazan数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析,细胞增殖越多越快,则颜色越深;细胞毒性越大,则颜色越浅。
CCK-8与以往的增殖/毒性测定试剂相比,具有明显优点(参考表1)。
表1.增殖/毒性测定试剂的比较
检测方法 | MTT法 | XTT法 | WST-1法 | CCK-8法 |
甲瓒产物的水溶性 | 差(需加有机溶剂溶解) | 好 | 好 | 好 |
检测灵敏度 | 高 | 很高 | 很高 | 最高 |
检测时间 | 较长 | 较短 | 较短 | 最短 |
检测波长 | 560~600nm | 420~480nm | 420~480nm | 430~490nm |
细胞毒性 | 高,细胞形态完全消失 | 很低,细胞形态不变 | 很低,细胞形态不变 | 很低,细胞形态不变 |
试剂稳定性 | 一般 | 较差 | 一般 | 很好 |
批量样品检测 | 可以 | 非常适合 | 非常适合 | 非常适合 |
便捷程度 | 一般 | 便捷 | 便捷 | 非常便捷 |
组分 | 100T | 500T | 1000T | 2000T | 10000T |
CCK-8增强型溶液 | 1mL | 5mL | 10mL | 5mL×4 | 10mL×10 |
说明书 | 1份 |
保存:4℃,避光,有效期1年。-20℃可以储藏更久,但反复冻融会增加背景值,干扰实验测定,因此请将经常使用的试剂保存在4℃。
- 建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。
- CCK-8反应时间的确定:一般情况下,白细胞显色比较困难,因此需要增加细胞数量和延长CCK-8反应时间。悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色,因此悬浮细胞在加入CCK-8培养0.5~4小时后,可先从培养箱取出,目测或用酶标仪测定显色程度,若显色困难可以继续培养数小时后再确定。对于贴壁细胞,CCK-8的培养时间一般为0.5~4小时,在培养20分钟左右即可取出肉眼观察显色程度。
- 每孔接种细胞数:当使用标准96孔板时,贴壁细胞的最小接种量至少为1000个/孔(100μL培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低,因此推荐接种量不低于2500个/孔(100μL培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验,请先计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。
- 设定空白对照:在不含细胞的培养基中加入CCK-8,培养一定的时间,测定450nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验(细胞毒性实验)时,还应考虑药物的吸收,可在加入药物的培养基中加入CCK-8,培养一定的时间,测定450nm的吸光度作为空白对照。
- 影响CCK-8测定的物质:由于CCK-8检测细胞活性的原理是通过检测活细胞脱氢酶催化的反应,所以如果待测体系中存在氧化还原物质则可能会干扰检测结果,还原性物质会使吸光度增加,氧化性物质会使吸光度减小,因此应需设法去除这些物质的影响。酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响,培养基中酚红的吸光度可以在计算时,通过扣除只含有培养基的对照孔中本底吸光度而消除,因此不会对检测结果造成影响。
- 测定波长:如果样品为高浑浊度的细胞悬液,建议采用双波长进行测定,检测波长450nm,参比波长600~650nm。如果没有450nm的滤光片,可以使用吸光度在430~490nm之间的滤光片,但是450nm检测灵敏度最高。
- 当在培养箱内培养时,培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发,由于体积不准确而增加误差。一般情况下,最外一圈的孔只加培养基,不作为测定孔用。
- 如果细胞培养时间较长,培养基颜色发生变化,应洗涤细胞更换培养基后再加CCK-8检测。
- 为了您的安全和健康,操作时请穿着实验服并佩戴一次性手套。
- 制作标准曲线(测定细胞具体数量时)
- 制备细胞悬液:细胞计数。
- 接种到96孔板中:按比例(例如:1/2比例)依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度,一般要做3~5个细胞浓度梯度,每组3~6个重复孔。每孔100μL细胞悬液。
- 37℃培养箱中培养:细胞接种后贴壁大约需要培养2~4小时,如果不需要贴壁,这步可以省去。
- 每孔加入10μL CCK-8增强型溶液:由于每孔加入CCK-8量比较少,有可能因试剂沾在孔壁带来误差,建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配制含10%CCK-8的培养基,以换液的形式加入。注意不要在孔中生成气泡,以免影响吸光度的检测。
- 培养箱内孵育一定时间后测定450nm吸光度,制作出一条以细胞数量为横坐标(X轴),吸光度为纵坐标(Y轴)的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量(使用此标准曲线的前提是实验的条件要一致,便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间。)
- 制备细胞悬液:细胞计数。
- 细胞活性检测
- 制备细胞悬液:细胞计数。
- 接种到96孔板中:根据合适的铺板细胞数,每孔100μL细胞悬液,可设置3个重复孔。
- 37℃培养箱中培养:细胞接种后贴壁大约需要培养24h小时,如果不需要贴壁,这步可以省去。也可以根据实验要求的不同,培养相应的时间。
- 每孔加入10μL CCK-8增强型溶液:由于每孔加入CCK-8量比较少,有可能因试剂沾在孔壁带来误差,建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配制含10% CCK-8的培养基,以换液的形式加入。注意不要在孔中生成气泡,以免影响吸光度的检测。
- 培养箱内孵育0.5~4小时:细胞种类不同,形成的Formazan的量也不一样,对于大多数情况孵育1小时即可。如果显色不够的话,可以继续培养,以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少,需要较长的显色时间(5~6小时)。
- 测定450nm吸光度:如果暂时不测定吸光度,可以向每孔中加入10μL CCK-8反应终止液,遮盖培养板避光保存在2~8℃,在7天内吸光度不会发生变化;或者可以向每孔中加入10μL自己配制的0.1M HCl溶液或1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下,在24小时内吸光度不会发生变化。
- 制备细胞悬液:细胞计数。
- 细胞增殖-毒性检测
- 制备细胞悬液:细胞计数。
- 接种到96孔板中:根据合适的铺板细胞数,每孔100μL细胞悬液,可设置3个重复孔。
- 37℃培养箱中培养:细胞接种后贴壁大约需要培养24h小时,如果不需要贴壁,这步可以省去。也可以根据实验要求的不同,培养相应的时间。
- 每孔加入0~10μL不同浓度的待测药物。
- 37℃培养箱中培养:加入待测药物的培养时间,要看该物质的性质和细胞的敏感性,一般要根据细胞周期来决定,起码要一代以上的时间。
- 每孔加入10μL CCK-8增强型溶液:由于每孔加入CCK-8量比较少,有可能因试剂沾在孔壁带来误差,建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配制含10% CCK-8的培养基,以换液的形式加入。注意不要在孔中生成气泡,以免影响吸光度的检测。
注意:如果待测物质有氧化性或还原性的话,可在加CCK-8之前除去培养基,并用培养基洗涤细胞两次,然后加入新的培养基,以去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。 - 培养箱内培养0.5~4小时:细胞种类不同,形成的Formazan的量也不一样,对于大多数情况孵育1小时即可。如果显色不够的话,可以继续培养,以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少,需要较长的显色时间(5~6小时)。
- 测定450nm吸光度:建议采用双波长进行测定,检测波长450~490nm,参比波长600~650nm。如果暂时不测定吸光度,可以向每孔中加入10μL CCK-8反应终止液,遮盖培养板避光保存在2~8℃,在7天内吸光度不会发生变化;或者可以向每孔中加入10μL自己配制的0.1M HCl溶液或1% w/v SDS溶液,并遮盖培养板避光保存在室温条件下,在24小时内吸光度不会发生变化。
- 制备细胞悬液:细胞计数。
- 计算公式:
细胞存活率= [(As - Ab)/(Ac - Ab)]×100%
抑制率= [(Ac - As)/(Ac - Ab)]×100%
As:实验孔(含有细胞的培养基、CCK-8、待测药物)的吸光度
Ac:对照孔(含有细胞的培养基、CCK-8、没有待测药物)的吸光度
Ab:空白孔(不含细胞和待测药物的培养基、CCK-8)的吸光度
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